Što je potrebno za vrhunske PCR rezultate

01 Čist laboratorijski uvjeti

Budući da je PCR sposoban otkriti jednu molekulu DNA, važno je zadržati netaknute stanja u laboratoriju. Uvijek nosite svježe rukavice; koristiti sterilne staklene posude, cijevi i pipete; i očistite radno područje prije početka rada.

Uvijek uključite kontrolne reakcije, bez predložaka DNK i bez enzima, kako bi se osiguralo da rezultati zaista dođu zbog pojačanja pravog uzorka.

Većina ljudi pobrinite se da imaju vlastiti skup rješenja koja se ne dijele kako bi olakšala rješavanje problema i da su određene pipete često stavljene na stranu samo za PCR. DNase i RNase-free PCR cijevi, aerosol otporne pipete savjete, a rade u dim zračne mornarice s UV svjetlo također su načini kako bi se smanjili problemi.

02 Kemijske komponente

Također od kritične važnosti je čistoća i integritet predložaka (pročišćena DNA) i primer dizajn. Postoji nekoliko softverskih programa koji su dostupni online za izradu primera. Najbolji primeri:

• Imaju 18 do 24 baze
• Nemate sekundarnu strukturu (npr. Petlje za kosu)
• Imaju uravnoteženu distribuciju G / C i A / T parova
• Nisu međusobno komplementarne na kraju 3 stopa
• Temperatura taljenja (Tm) iznosi oko 5-10 stupnjeva Celzija ispod temperaturi žarenja, obično između 55 i 65 stupnjeva Celzijusa. Tm za oba primera također bi trebao biti sličan za najbolje rezultate.

03 Mix reakcije: Predložak i temeljni premazi

Proporcije reakcijske smjese imaju veliki utjecaj na kvalitetu PCR rezultata. Postoji opća formula za koncentraciju predložaka, enzima, primera i nukleotida za upotrebu, ali to može biti malo ugađano.

Optimalne koncentracije primera su između 0,1 i 0,6 mikromola / L. Količina predložaka varira ovisno o vrsti DNK (ljudski, bakterijski, plazmid).

Uz vrlo niske količine predložaka, postoje i druge strategije za poboljšanje rezultata, kao što su povećani broj ciklusa ili upotreba "vrućeg početka". Uvijek testirati nove primere s pozitivnom kontrolnom reakcijom, kako biste bili sigurni da rade u vašim specifičnim eksperimentalnim uvjetima.

04 Reakcijska smjesa: enzimska aktivnost

Izbor DNA polimeraze utječe na vjerodostojnost reakcije i kvalitetu produkta. Tradicionalna Taq polimeraza zamijenjena je u mnogim laboratorijima pomoću viših vjernosti enzima (oni koji čine manje pogrešaka).

Koncentracija MgCl2 u reakcijskoj mješavini može utjecati na ishod PCR i može imati važnu ulogu u bržim reakcijama. Magnezijev kation formira topive komplekse s dNTPs kako bi se proizveo stvarni supstrat koji enzim polimeraze prepoznaje.

Jednake količine svih četiri dNTP-a također pomažu smanjiti brzinu pogrešaka polimeraze. Određeni aditivi kao što su betain, BSA, deterdženti, DMSO, glicerol i pirofosfataza također mogu utjecati na enzimsku specifičnost ili učinkovitost reakcije.

05 Vrsta Thermocycler

Kada kupujete laboratorijsku opremu, imajte na umu da su neki termocikli manje precizni od drugih u održavanju točnih, željenih temperatura.

Ovo je jedno područje na kojem se odlaskom na jeftinost neće dugoročno isplatiti kada se suočite s finickom reakcijom ili korištenjem prajmera koji zahtijevaju uski raspon temperature žarenja.

Reakcijske cijevi s tankim zidovima dizajnirane da odgovaraju preciznoj marki termociklača koje koristite također pomažu u optimiziranju reakcijskih temperatura.

06 Postavke ciklusa

Duljine ciklusa reakcije, temperature i broj ciklusa imaju ključnu ulogu u određivanju koliko će PCR funkcionirati. Početni korak grijanja mora biti dovoljno dug da potpuno denaturira predložak, a ciklusi moraju biti dovoljno dugi da spriječi rastopljenu DNK od povratka na sebe.

Povećan prinos može se postići povećanjem vremena produženja oko svakih 20 ciklusa, kako bi se nadoknadilo manje enzima za pojačavanje više predložaka. Obično je manje od 40 ciklusa dovoljno da se pojačaju manje od 10 molekula predložaka u koncentraciji dovoljno velikom da se vidi na agaroznom gelu obojanom etidij bromidom.