Tehnike za sekvenciranje DNA

Područje biotehnologije jedno je od stalnih promjena. Brz rast i razvoj najsuvremenijih istraživanja ovise o inovativnosti i kreativnosti znanstvenika i njihovoj sposobnosti da vide potencijal u osnovnoj molekularnoj tehnici i primjenjuju ga na nove procese. Pojava PCR-a otvorila je mnoga vrata u genetskim istraživanjima, uključujući sredstvo DNA analize i identifikacije različitih gena zasnovanih na njihovim DNA sekvencama. Sekvenciranje DNA također ovisi o našoj sposobnosti da se koristi gel elektroforeza u odvojene niti DNA koji se razlikuju po veličini za samo jedan par baze.

DNA sekvenciranje

Krajem 1970-ih izumljena su dva tehnika sekvenciranja DNA za duže molekule DNA: Sanger (ili dideoksi) metodu i metodu Maxam-Gilbert (kemijski cijepanje). Metoda Maxam-Gilbert temelji se na nukleotidno specifičnom cijepanju kemikalijama i najbolje se koristi za sekvenciranje oligonukleotida (kratki nukleotidni polimeri, obično manji od 50 osnovnih parova duljine). Metoda Sanger se uobičajeno koristi jer se dokazano tehnički lakše primjenjuje, a uz pojavu PCR i automatizaciju tehnike, lako se primjenjuje na dugačke dijelove DNK, uključujući neke cjelovite gene.

Ova se tehnika temelji na prestanku lanca dideoksinukleotidima tijekom reakcije PCR elongacije.

Metoda Sanger

U Sangerovoj metodi, DNA lanac koji se treba analizirati koristi se kao predložak i DNA polimeraza se koristi u PCR reakciji, da se dobiju komplementarne linije pomoću primera. Pripremljene su četiri različite PCR reakcijske smjese, od kojih svaka sadrži određeni postotak dideoksinukleozid trifosfata (ddNTP) analoga na jedan od četiri nukleotida (ATP, CTP, GTP ili TTP).

Sinteza novog DNK lika nastavlja sve dok se ne ugradi jedan od tih analoga, u kojem trenutku cjedilu je prerano skraćeno. Svaka će PCR reakcija završiti koja sadrži mješavinu različitih duljina DNK niti, a sve završava nukleotidom koji je dideoksi obilježen za tu reakciju. Gel elektroforeza se zatim koristi za odjeljivanje niti od četiri reakcije, u četiri odvojene staze i određivanje slijeda izvornog predloška na temelju duljine niti enda s nukleotidom.

U automatiziranoj Sanger reakciji koriste se početnice koje su označene s četiri različite fluorescentne oznake u boji. PCR reakcije, u prisutnosti različitih dideoksinukleotida, izvedene su kako je gore opisano. Međutim, sljedeće, četiri reakcijske smjese su zatim kombinirane i nanesene na jednu traku gela. Boja svakog fragmenta detektira se pomoću laserske zrake, a podaci prikupljaju računalo koje generira kromatograme koji prikazuju vrhove za svaku boju, od kojih se može odrediti predložak DNA sekvenca.

Tipično, automatizirana sekvencijska metoda je samo točna za sekvence do maksimalno oko 700-800 parova duga u dužini. Međutim, moguće je dobiti potpune sekvence većih gena i, zapravo, cjelokupnih genoma, upotrebom koristan postupaka kao što su Primer Walking i Shotgun sekvencioniranje.

U Primer Walkingu, djelotvoran dio većeg gena se sekvencionira pomoću Sanger metode. Novi početnici su generirani iz pouzdanog segmenta sekvence i korišteni za nastavak sekvencioniranja dijela gena koji nije bio u rasponu od izvornih reakcija.

Slijed sekcija uzrokuje slučajno rezanje DNA segmenta interesa u prikladnije (rukovanje) veličine fragmenata, sekvenciranje svakog fragmenta i uređivanje dijelova na temelju preklapajućih sekvenci. Ta je tehnika olakšana primjenom računalnog softvera za uređenje preklapajućih komada.