Sve o restrikcijskim enzimima

Restrikcijske endonukleaze su klasa enzima koji rezaju DNA molekule. Svaki enzim prepoznaje jedinstvene sekvence nukleotida u DNK lancu - obično oko četiri do šest baza parova dugo. Sekvence su palindromne po tome što komplementarni DNA lanac ima isti slijed u obrnutom smjeru. Drugim riječima, oba niza DNA se rezaju na istom mjestu.

Gdje se nalaze ovi enzimi

Restrikcijski enzimi nalaze se u mnogim različitim vrstama bakterija gdje njihova biološka uloga sudjeluje u obrani stanica. Ovi enzimi ograničavaju stranu (virusnu) DNA koja ulazi u stanice uništavajući ih. Stanice domaćini imaju sustav restrikcijsko-modifikacije koji metilizira vlastitu DNA na mjestima specifičnim za svoje restrikcijske enzime, čime ih štiti od cijepanja. Otkriveno je više od 800 poznatih enzima koji prepoznaju više od 100 različitih nukleotidnih sekvenci.

Vrste restrikcijskih enzima

Postoji pet različitih vrsta restrikcijskih enzima. Tip I prekida DNK na nasumičnim mjestima do 1000 ili više osnovnih para s mjesta prepoznavanja. Tip III smanjuje približno 25 osnovnih para od mjesta. Obje ove vrste zahtijevaju ATP i mogu biti veliki enzimi s višestrukim podjedinicama. Tipi II enzimi, koji se pretežno koriste u biotehnologiji, rezaju DNA unutar priznatih sekvenci bez potrebe za ATP-om, te su manji i jednostavniji.

Restrikcijski enzimi tipa II su imenovani prema bakterijskim vrstama iz kojih su izolirani. Na primjer, enzim EcoRI je izoliran iz E. coli. Većina javnosti upoznata je s epidemijom E. coli u hrani.

Vrste restrikcijskih enzima tipa II mogu stvoriti dva različita tipa rezova, ovisno o tome jesu li obje niti u sredini sekvencije prepoznavanja ili svaki lanac bliži jednom kraju sekvencije prepoznavanja.

Bivši rez rezultira "tupim krajevima" bez nukleotidnih prevjesa. Ovo potonje stvara "ljepljive" ili "kohezivne" krajeve, jer svaki rezultirajući fragment DNK ima izbočinu koja nadopunjuje ostale fragmente. Obje su korisne u molekularnoj genetici za izradu rekombinantne DNA i proteina. Taj oblik DNA ističe se zato što se proizvodi ligacijom (povezivanjem) dva ili više različitih niti koji nisu bili izvorno povezani.

Enzimi tipa IV prepoznaju metiliranu DNK, a tip V enzimi rabe RNA za rezanje sekvenci na invazivnim organizmima koji nisu palindromni.

Upotreba u biotehnologiji

U biotehnologiji koriste se restrikcijski enzimi kako bi se DNA uklonila u manji dio kako bi se proučavale razlike duljine fragmenta među pojedincima. To se naziva polimorfizam duljine ograničenja fragmenta (RFLP). Također se koriste za kloniranje gena.

RFLP tehnike korištene su kako bi se utvrdilo da pojedinci ili skupine pojedinaca imaju specifične razlike u sekvencijama gena i obrascima cijepanja restrikcije u određenim područjima genoma. Poznavanje tih jedinstvenih područja temelj je za otiske prstiju DNA. Svaka od ovih metoda ovisi o upotrebi agaroza gel elektroforeze za odvajanje DNA fragmenata. TBE pufer, koji se sastoji od baze Tris, borne kiseline i EDTA, obično se koristi za elektroforezu agarozne gage za ispitivanje DNA produkata.

Koristite u kloniranju

Kloniranje često zahtijeva umetanje gena u plazmid, koji je vrsta komada DNA. Restrikcijski enzimi mogu pomoći u procesu zbog jednolančanih presjeka koje napuštaju kada rezultiraju. DNA ligaza, zaseban enzim, može udružiti dvije DNA molekule s odgovarajućim krajevima.

Dakle, korištenjem restrikcijskih enzima s enzimima DNA ligaze, dijelovi DNA iz različitih izvora mogu se upotrijebiti za stvaranje jedne DNA molekule.