DNA pojačanje kroz reakciju polimeraznih lanaca

PCR označava lančanu reakciju polimeraze, tehniku ​​molekularne biologije za pojačavanje segmenata DNA, stvaranjem višestrukih kopija pomoću enzima DNA polimeraze pod kontroliranim uvjetima. Jednaka kopija DNK segmenta ili gena može se klonirati u milijune primjeraka, čime se omogućuje otkrivanje pomoću boja i drugih tehnika vizualizacije.

Razvijen je 1983. godine, proces PCR omogućio je sekvencioniranje DNA i odredio redoslijed nukleotida u pojedinim genima. Metoda koristi toplinsku ciklizaciju ili ponovljeno zagrijavanje i hlađenje reakcije za topljenje i replikaciju DNA. Dok se PCR nastavi, "nova" DNA se koristi kao predložak za replikaciju i slijedi lančana reakcija, eksponencijalno pojačavajući DNK predložak.

PCR tehnike primjenjuju se u mnogim područjima biotehnologije, uključujući inženjerstvo proteina, kloniranje, forenziku (DNA fingerprinting), testiranje očinstva, dijagnozu nasljednih i / ili zaraznih bolesti te za analizu uzoraka okoliša.

Za forenzičare, osobito, PCR je osobito korisno jer pojačava čak i najmanju količinu DNA dokaza. PCR se također može upotrijebiti za analizu DNA koja je stara tisućljeća, a ove su tehnike korištene za identifikaciju sve od 800.000 godina starog mamuta do mumija iz cijelog svijeta.

PCR postupak je kako slijedi:

• Inicijalizacija: Ovaj korak je neophodan samo za DNA polimeraze koje zahtijevaju vrući početak PCR. Reakcija se zagrijava na između 94 i 96 ° C i drži se 1-9 minuta.
• denaturacije: Ako postupak ne zahtijeva inicijalizaciju, denaturacija je prvi korak. Reakcija se zagrijava do 94-98 ° C 20-30 sekundi. Vodene veze DNA predloška su poremećene i nastaju jednolančane DNA molekule.
• žarenja: Reakcijska temperatura je niža na između 50 i 65 ° C i držana je 20-40 sekundi. Primeri se anne u jednolančani DNK predložak. Temperatura je iznimno važna tijekom ovog koraka. Ako je previše vruće, premaz se možda neće vezati. Ako je previše hladno, temeljni premaz može se nesavršiti. Dobra veza nastaje kada se sekvenca za početak blisko podudara s slijedom predložaka.

• Proširenje / Istezanje: Temperatura tijekom ovog koraka ovisi o vrsti polimeraze. DNA polimeraza sintetizira potpuno novi DNA lanac.
• Završna istezanja: Ovaj se korak izvodi na 70-74 ° C tijekom 5-15 minuta nakon završnog PCR ciklusa.
• Završno zadržavanje: Ovaj je korak opcionalan. Temperatura se održava na 4-15 ° C i provodi reakciju.

Postupak je podijeljen u tri faze:

• Eksponencijalno pojačanje: Tijekom svakog ciklusa, proizvod (specifičan dio DNK koji se replicira) udvostručuje se.
• Razina izravnavanja: Kako DNA polimeraza gubi aktivnost i troši reagense, reakcija se usporava.
• Plato: Nema više proizvoda akumulira.